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18 2017-01

常用培養基的選擇、製備、滅菌與消毒

責任編輯:admin   文章來源:未知

選擇基本培養基時,除待培養植物的基因型外,通常應考慮培養基的種類,其總離子濃度、總氮水平及氮源種類(硝態氮和銨態氮)與比例、鈣和氯化物的含量等。草本植物組織培養廣泛使用的MS培養基,而木本植物組織培養通常采用低鹽基本培養基如1/2或1/4MS或WPM(Woody Plant Medium,木本植物培養基)。除總離子濃度外,總氮水平、氮源種類(硝態氮和銨態氮)與比例也對組織培養影響甚大,因此根據具體情況改變基本培養基的氮源類型和濃度,可以提高培養效果[15~17]。

不同基因型可能需要不同的基本培養基,但同一種植物在培養的不同階段或適用於不同的培養目的時,所需基本培養基也不同。通常按培養階段和目的可劃分為啟動或誘導培養基、增殖培養基、生根培養基等多種,這種劃分可能僅僅是激素的調整,或同一基本培養基某些成分的改變,甚至基本培養基種類的不同。如大多數植物在生根培養時使用1/2~1/4 MS或其他低鹽培養基如White培養基,體細胞胚胎發生也經常在不同階段要改變氮源的類型和比例等。基本培養基種類也可能影響到生長調節物質的作用效果,因此需要考慮不同基本培養基與不同濃度的生長調節物質之間的互作。

通常在對一種植物進行組織培養前,首先應查尋同屬、同種或同品種植物組織培養的有關資料,參考前人的研究成果。無法查找到有關資料,可以一些著名的基本培養基如MS、WPM或B5等開始試驗。如果對現有的基本培養基的篩選效果不理想,可以以MS、WPM或B5等基本培養基為基礎進行改良,改良的方法一般有以下幾種:

(1)將基本培養基的大量成分或無機鹽成分減半至減四分之三(1/2,1/3,2/3,1/4,或3/4),或不同基本培養基成分組合如將B5的無機鹽成分與MS的有機成分組合在一起等;
(2)增減氮源水平及調銨態氮和硝態氮(銨鹽和硝酸鹽)的種類和比例,氮源通常對培養物的質量和發育路線影響較大;
(3)增加鈣鹽,以改善木本植物培養中的鈣缺乏;
(4)附加多種維生素、氨基酸及有機添加物,這對營養需求複雜或難培養的植物較為有效;
(5)對植物生長土壤及體內營養物質含量進行測定,給基本培養基改良提供參考;
(6)將無機鹽、有機成分及生長素和細胞分裂素劃分為高、中、低三個水平,進行81(34)種組合試驗,這樣更為精確。總之,可通過培養基質量(成分)和數量(濃度)調整,優化和選擇與既定植物材料的特定要求相適合的基本培養培養基。

植物組織培養基中經常改變的因子是生長調節物質,尤其是生長素和細胞分裂素。生長素和細胞分裂素的種類、數量和比例通常根據經驗或激素的性質與功能確定。但更科學的方法是采用單因子試驗法和多因子試驗法(正交設計),這樣可以采用生物統計學方法對結果進行分析。如以一種基本培養基為基礎,將生長素(如NAA)和細胞分裂素(如BA)各以 9種濃度水平(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/l)組合成81種處理,可以得到最好的生長素和細胞分裂素濃度水平的組合。正交設計雖然科學合理,考慮到了兩類激素之間的互作,但工作量較大。

實踐中也可以采用固定生長素濃度,改變細胞分裂素種類或濃度,選擇最優的細胞分裂素種類和濃度;以及反過采用同樣的方法也可對生長素進行選擇。或者有時為減少工作量,可代表性地配製數量較少的幾種組合(如生長素濃度相對高的一種,細胞分裂素濃度高的一種,生長素和細胞分裂素相平衡的一種),首先確定那類較為適合,然後根據適合的一類,利用單因子或多因子試驗法進一步確定最適激素組合。確定最適光照和溫度等因子的方法也同此。

製備、滅菌與消毒:
一、實驗目的 
了解培養基的配製原理;掌握配製培養基的一般方法和步驟;了解常見滅菌、清毒基本原理及方法;掌握幹熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。 

二、實驗原理 
培養基是人工按一定比例配製的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養物質的混合物。培養基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據微生物的種類和實驗目的不同,培養基也有不同的種類和配製方法。 

牛肉膏蛋白腖培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基,有時又稱為普通培養基。由於這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養物質,所以可供微生物生長繁殖之用。 

幹熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。 

三、試劑與器材 
1.器材 
試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。 

2.試劑 牛肉膏、蛋白腖、NaCl、瓊脂 

四、實驗內容 
1.稱量→溶化→調pH→過濾→分裝→加塞→包紮→滅菌→無菌檢查 
2.幹熱滅菌:裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開箱取物 
3.高壓蒸汽滅菌:加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查 
4.過濾除菌:組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌 

五、關鍵步驟及注意事項 
1.要嚴格按配方配製。 
2.調pH不要過頭。 
3.幹熱滅菌要注意物品不要堆放過緊,注意溫度的時間控製,70oC以下放物、取物。 
4.高壓滅菌要注意物品不要過多,加熱後排除冷空氣,到時降壓回零取物。 
5.過濾除菌要注意各部件滅菌,壓濾時,壓力要適當,不可太猛太快,濾膜要注意清洗保存。